原文出处
CastellanosJG,WooV,ViladomiuM,PutzelG,LimaS,DiehlGE,MardersteinAR,GandaraJ,PerezAR,WithersDR,TarganSR,ShihDQ,ScherlEJ,LongmanRS.Microbiota-InducedTNF-likeLigand1ADrivesGroup3InnateLymphoidCell-MediatedBarrierProtectionandIntestinalTCellActivationduringColitis.Immunity.;49(6):-.e5.
研究背景
炎症性肠病(IBD)为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。一般认为,IBD的发病机制是多方面的,包括肠道内环境的失调及基因易感受体。与健康人体相比,IBD患者的肠道菌群发生了明显的改变,菌群多样性显著减少。基因研究已发现超过种基因与IBD的易感性相关,但这些基因是如何影响肠道内稳态并引起IBD,对此我们还知之甚少。IBD患者的全基因组相关性研究发现,TNFSF15基因突变与克罗恩病的发病存在显著相关性,且TNFSF15基因编码的蛋白-TNF-likeligand1A(TL1A)在粘膜免疫中发挥着重要作用,但关于TL1A在IBD中的作用一直存在争议。近日,一篇发表在Immunity上,题为Microbiota-InducedTNF-likeLigand1ADrivesGroup3InnateLymphoidCell-MediatedBarrierProtectionandIntestinalTCellActivationduringColitis的研究表明:IBD相关TL1A一方面在调节3型天然免疫淋巴细胞(Group3InnateLymphoidCell,ILC3)屏障免疫中发挥主要作用,另一方面TL1A可诱导MHCII+ILC3s表面共刺激分子OX40L的表达,促进结肠炎的进展。
研究结果
结果1:在急性结肠炎中单核巨噬细胞来源TLA可促进肠道屏障的保护作用
有研究表明,在活动期的结肠炎中,结肠组织内TL1A的表达增加。为探究细胞来源的TL1A在人肠道中的作用,研究人员对固有层单核巨噬细胞进行了TL1A染色,结果发现,与淋巴细胞相比,TL1A的表达在CD14+HLA-DRhi肠道单核巨噬细胞中显著增高(图1A)。对经内镜活检获取的健康个体和克罗恩病患者肠道内的固有层单核巨噬细胞进行流式细胞术分析发现,处于活动期的克罗恩病患者的单核巨噬细胞表面有更高水平的TL1A表达(图1B)。已有研究表明,在小鼠模型中,将白喉毒素受体(DTR)插入其Cx3cr1基因座可选择性的清除CX3CR1+单核巨噬细胞,再次注射白喉毒素后肠道固有层中TL1A的表达显著下降(图1C)。以上结果表明,CX3CR1+单核巨噬细胞是肠道内TL1A的主要来源,在克罗恩病处于活跃期时,TL1A的表达显著上调。
为探究单核巨噬细胞来源的TL1A在结肠炎中的作用,研究人员利用构建了条件性敲除Tnfsf15(Tnfsf15flox/flox)基因的小鼠从而实现了在表达CD11c的细胞中敲除TL1A,随后用2%DSS处理小鼠7天,结果发现与正常小鼠相比,TL1A△CD11c小鼠的体重明显降低(图1D)。为检测单核巨噬细胞来源的TL1A在体内的作用,研究人员将TL1A△CX3CR1小鼠及其同窝幼崽用2%DSS处理7天,结果发现,与对照组小鼠相比,TL1A△CX3CR1小鼠的体重明显降低且出现更严重的组织病理学损伤(图1E、F)。
已有研究表明,TL1A可影响T细胞和固有淋巴细胞的功能,研究人员进一步探究了单核巨噬细胞来源的TL1A对淋巴细胞效应分子的影响,固有层单核巨噬细胞的流式结果表明,TL1A基因敲除小鼠肠道内ILC3s产生IL-22的水平下降(图1H)。以上结果表明,在急性结肠炎中,单核巨噬细胞来源的TL1A在调节先天免疫反应中发挥重要作用。
结果2:克罗恩病患者肠道内的粘附性细菌可诱导CX3CR1+单核巨噬细胞表达TL1A
有研究表明,CX3CR1+单核巨噬细胞是唯一定位于肠道屏障与肠道菌群相接触,并通过Toll样受体与肠道微生物产物产生应答诱导人抗原提呈细胞表达TL1AmRNA。为探究肠道微生物与单核巨噬细胞的关系,研究人员观察了MyD88缺失对于肠道单核巨噬细胞表达TL1A的影响,结果发现,MyD88基因缺失小鼠体内单核巨噬细胞表达TL1A明显较少(图2A)。为探究肠道菌群对TL1A表达影响,研究人员利用流式比较了无菌小鼠和普通小鼠肠道内TL1A的表达情况。结果发现,与普通小鼠相比,无菌小鼠肠道内单核巨噬细胞表达TL1A的水平显著下降(图2B)。已有研究表明,肠道上皮表面的粘附性细菌在调节肠固有层内的免疫反应中发挥关键作用,如紧贴回肠粘膜的细菌可诱导Th17和ILC3效应分子的表达。考虑到CX3CR1+单核巨噬细胞在调节Th17和ILC3效应分子中也发挥重要作用,研究人员进一步探究了肠道菌群在调节TL1A表达中的作用。研究人员将普通小鼠的肠道菌群定植在无菌小鼠体内,结果发现,与无菌小鼠相比,定植普通小鼠菌群后,小鼠肠固有层内单核巨噬细胞表达TL1A的mRNA水平显著增高。此外,研究人员将来自克罗恩患者体内的粘附性大肠杆菌2A与非粘附性大肠杆菌T75在小鼠体内定植,5天后发现只有粘附性大肠杆菌2A定植后可诱导小鼠结肠固有层内TL1AmRNA的表达(图2C)。研究人员又利用抗生素清除了普通小鼠肠道内的细菌随后通过流式检测了单核巨噬细胞TL1A蛋白的表达水平。结果发现,与正常小鼠相比,抗生素处理小鼠肠道单核巨噬细胞内TL1A蛋白的表达水平显著降低(图2D)。给正常小鼠定植粘附性大肠杆菌2A可得到相同的结果(图2E)。已有研究表明,在结肠炎发病期间,单核巨噬细胞产生细胞因子的水平增加。为探究是否结肠炎可改变单核巨噬细胞表达TL1A的水平,研究人员通过使用DSS建立小鼠结肠炎模型并检测单核巨噬细胞表达TL1A的mRNA水平,结果发现,DSS处理后小鼠体内TL1AmRNA水平的表达增加,且定植粘附性大肠杆菌2A后其表达水平进一步提高(图2E)。以上结果表明,粘膜相关的菌群可诱导单核巨噬细胞表达TL1A,并在结肠炎发病期间增加其表达水平。
前期研究已表明粘附性大肠杆菌定植可诱导小鼠体内ILC3s表达IL-22,并减少DSS引起的急性结肠炎小鼠的死亡率。为探究TL1A在其中的作用,研究人员将粘附性大肠杆菌定植在抗生素处理的小鼠体内,结果发现,定植粘附性大肠杆菌后,TL1A△CD11c小鼠不能像野生型小鼠恢复IL-22的表达(图2F)。为探究粘附性大肠杆菌的保护性作用是否依赖于单核巨噬细胞来源的TL1A,研究人员对TL1A△CD11c小鼠和对照组小鼠进行广谱抗生素预处理并在DSS处理前给小鼠定植粘附性大肠杆菌2A。结果发现,定植大肠杆菌对各组小鼠体重无明显影响,但广谱抗生素预处理的无菌小鼠,DSS处理后生存率显著下降,给野生型小鼠定植粘附性大肠杆菌2A,可使小鼠免于DSS引起的死亡,但单核巨噬细胞中条件性敲除TL1A的小鼠,定植粘附性大肠杆菌2A则无保护性作用,说明大肠杆菌的保护性作用依赖于单核巨噬细胞来源的TL1A(图2G)。总之,上述结果表明,在急性结肠炎发病过程中,IBD相关的粘附性细菌可诱导单核巨噬细胞来源的TL1A的表达。
结果3:ILC3特异性DR3的缺失可减少IL-22的表达并加重结肠炎的进展
由于Deathreceptors3(DR3)为TL1A的单一配对受体,为进一步探讨TL1A在体内的作用,研究人员构建了DR3基因缺失小鼠(Tnfrsf25-/-)并用2%的DSS处理以建立结肠炎模型。结果发现,与对照组小鼠相比,Tnfrsf25-/-小鼠的结肠炎症状更为严重,其体重和生存率下降更为明显(图3A、B),且肠固有层内的ILC3s表达IL-22的水平下降(图3C)。给DSS处理的Tnfrsf25-/-小鼠注射IL-22,小鼠的结肠炎症状得以改善,生存率明显升高(图3D)。结果提示,ILC3s产生的IL-22可能在调节DR3依赖性的粘膜修复中发挥作用。
有研究表明CD4+T细胞也可产生IL-22,为探讨ILC3s内源性的DR3信号产生的IL-22在保护肠道屏障中的特异作用,研究人员构建了与ILC3s中条件性敲除DR3基因的小鼠(DR3△ILC3),并继续用DSS诱导小鼠结肠炎的发生。结果发现,DSS处理后DR3△ILC3小鼠比对照组小鼠的体重下降更为明显(图3E),组织病理损伤更为严重(图3F),且IL-22的表达水平也明显下降(图3G),再给DR3△ILC3小鼠注射IL-22后,小鼠的生存率同样出现了明显的回升(图3E)。此外,DR3△ILC3小鼠肠上皮细胞中与维持肠道屏障功能相关的的抗菌肽(Reg3g)和血清淀粉样A1(Saa1)的表达均下降(图3H)。以上说明,在结肠炎中ILC3s缺乏DR3后可减少IL-22的表达,影响肠上皮的屏障功能。
为进一步探讨ILC3s表面的DR3在维持肠屏障功能中的作用,研究人员给小鼠喂养鼠柠檬酸杆菌(依赖ILC3s反应)以建立感染性结肠炎模型,结果发现,与对照组小鼠相比,DR3△ILC3小鼠经柠檬酸杆菌处理后体重和生存率均下降更为明显(图3I)。以上结果表明,TL1A可通过ILC3s表面的DR3调节ILC3s产生IL-22的水平,并在结肠炎肠道粘膜的修复中具有保护性作用。
结果4:在急性结肠炎中,TL1A与IL-23可通过p38MAPK信号发挥协同作用促进肠粘膜的愈合
为探究TL1A调节ILC3s来源的IL-22的具体机制,研究人员取小鼠小肠固有层的ILC3s在体外培养,并分别用TL1A、IL-23或TL1A+IL-23对细胞进行刺激,结果发现,TL1A或IL-23单独使用均可诱导IL-22的转录,但当二者合用时IL-22的转录水平更高(图4A)。此外,DR3基因缺失的纯合子小鼠来源的ILC3s在接受TL1A+IL-23的刺激后并没有出现IL-22高表达的情况(图4B),说明TL1A与IL-23的协同作用是DR3依赖性的。所有ILC3s均表达DR3,而在TL-1A刺激后,所有ILC3s亚型表达IL-22的水平均升高(图4C),再次说明了在TL1A调节ILC3s产生IL-22的过程中,DR3在其中发挥关键作用。
DR3下游的常规信号通路是MAPK和NF-KB信号通路。为探究TL1A在调节ILC3s产生IL-22过程中的具体信号通路,研究人员对DR3下游分子的磷酸化水平进行了检测。流式细胞术的结果表明,用TL1A刺激ILC3s后,IkBa和p38-MAPK均被磷酸化(图4D)。为确定TL1A依赖性信号通路,研究人员在用TL1A刺激前,向ILC3s培养皿中加入NF-KB抑制剂(NBD)或p38MAPK抑制剂(SB)。结果发现,加入NF-KB抑制剂后并不影响IL-22的表达,而加入p38MAPK抑制剂后则显著阻断了TL1A与IL-23协同促进IL-22表达的作用(图4E)。
为进一步验证TL1A与IL-23促进肠粘膜愈合的协同作用,研究人员构建了同时敲除DR3和IL-23基因的小鼠并用DSS诱导其结肠炎的发生,结果发现,与单一敲除DR3或IL-23基因的小鼠相比,DR3和IL-23基因同时敲除的小鼠经DSS处理后生存率明显下降(图4G)。以上结果表明,TL1A与IL-23可通过p38MAPK信号在急性结肠炎中发挥保护性作用。
结果5:TL1A可诱导MHCII+ILC3表达CD4+T细胞的共刺激分子—OX40L
有研究表明,TL1A在IBD中存在致病性作用。为探究TL1A与ILC3s是否可促进IBD的进展,研究人员继续用TL1A刺激ILC3s,并对刺激后的ILC3s进行了转录组测序,测序结果发现TL1A刺激后ILC3s表面的共刺激分子OX40L的表达显著上调(图5A),PCR结果显示编码OX40L的基因Tnfsf4表达上调(图5B),流式结果表明,接受TL1A刺激后ILC3s的所有亚型均表达OX40L(图5C)。
以往的研究表明,MHCII+ILC3表面缺乏T细胞共刺激分子,不能调节T细胞对于共生菌的反应。为探究TL1A诱导的共刺激分子OX40L是否可促进抗原特异性T细胞的反应,研究人员提取出MHCII+ILC3和MHCII-ILC3将其与对卵清蛋白肽敏感的CD4+T细胞共培养并加入卵清蛋白肽或TL1A刺激,结果发现,MHCII+ILC3可使CD4+T细胞大量增殖,而MHCII-ILC3却无此作用(图5D、E)。为进一步探究ILC3s表面的OX40L在刺激T细胞中的作用,研究人员将ILC3s与对卵清蛋白肽敏感的CD4+T细胞共培养,并向培养皿中加入卵清蛋白肽、TL1A或OX40L的阻滞剂,结果发现,阻断OX40L后可明显抑制CD4+T细胞的增殖(图5G),此外OX40L基因敲除鼠体内的ILC3s在TL1A的刺激下同样不能诱导CD4+T细胞的增殖(图5H)。为证明OX40L作为共刺激信号发挥作用,研究人员取MHCII基因敲除小鼠的ILC3s与CD4+T细胞共培养并加入TL1A刺激,结果发现,MHCII基因敲除小鼠的ILC3s无法促进CD4+T细胞的增殖(图5I)。以上结果表明,TL1A可诱导MHCII+ILC3表达共刺激分子OX40L。
结果6:炎症性肠病中TLC3表达的OX40L可促进炎症性T细胞的增殖
为探究结肠炎期间ILC3s表达OX40L的情况,在动物层面,研究人员比较了正常小鼠与DSS诱导的结肠炎小鼠肠道内ILC3s,结果发现,两种ILC3s均有OX40L的表达,但结肠炎小鼠肠道内ILC3s表面OX40L的表达显著增高(图6A),且在DR3基因缺失小鼠中MHCII+ILC3表达OX40L的水平显著下降(图6B),说明了TL1A在促进ILC3表达OX40L中的重要作用。在临床患者层面,研究人员从活检组织中获取了人肠道内的ILC3s,发现来自急性期克罗恩病人肠道内的ILC3s表面可表达更高水平的OX40L(图6C)。
为探究TL1A诱导的ILC3s表达的OX40L在调节肠道T细胞反应中的作用,研究人员将naiveCD45.1+OT-ⅡCD4+T细胞注入OX40L基因敲除小鼠体内并加入卵清蛋白抗原,用DSS诱导后发现,OX40L基因敲除小鼠肠道内分化的CD45.1+CD4+T细胞明显下降(图7A)。进一步的研究发现ILC3s主要针对的是T-BET+细胞(图7B)。
为检测表达OX40L的ILC3s是否可调节炎症性T细胞结肠炎,作者使用了T细胞输注结肠炎模型。研究人员将CD4+CD45RBhighnaiveT细胞输注给OX40L基因敲除小鼠和对照小鼠,结果发现,与对照组小鼠典型的T细胞结肠炎表现,即体重不增及肠腔炎症相比,OX40L基因敲除小鼠在饲养过程中体重继续升高,肠腔亦无炎症表现(图7C、D),其结肠内的CD4+T细胞产IFN-γ和T-BET的水平下降(图7E、F)。在ILC3s中特异性敲除DR3的小鼠中复制上述T细胞输注结肠炎,结果显示,特异性敲除DR3的小鼠输注naiveT细胞后,继续饲养过程中,小鼠体重继续增加,无死亡,肠腔肠炎症反应较弱(图7G),组织病理学损伤较轻(图7H)T-BET+CD4+T的数量明显较低,这些指标均明显优于对照组小鼠(图7I)。以上结果表明,在慢性T细胞肠炎中,TLC3表达的OX40L可促进炎症进展。
研究结论
在急性结肠炎中,肠道粘附性细菌可促进肠道单核巨噬细胞表达TL1A并与IL-23协同促进ILC3s表达IL-22,从而促进肠道黏膜的修复;而在慢性炎症性结肠炎中,TL1A可通过ILC3s表面的DR3促进ILC3s表面共刺激分子OX40L的表达,促进T-BET细胞的增殖,从而发挥促炎作用。
校对:永平
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