文章来源：中华消化杂志,,39(7)
作者：战蓉蓉、王冬、贾文秀、宋佳、吴梦瑶、李辉、尹凤荣、王娜、彭晨星、张红、宋梅、陈爽、ShihDavidQuan、张晓岚
摘要目的：探讨肿瘤坏死因子样配体1A(TL1A)在慢性实验性结肠炎相关肠纤维化中的作用与机制。
方法：通过右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立慢性实验性结肠炎相关肠纤维化模型，将淋系细胞高表达TL1A(L-Tg)小鼠和具有相同遗传背景的野生型小鼠分成野生型对照组、野生型DSS组、转基因对照组和转基因DSS组。比较各组小鼠体质量、结肠长度、疾病活动指数(DAI)评分和结肠病理评分的变化，采用H-E染色评估结肠炎症程度，Masson染色与天狼星红染色评估肠纤维化程度，免疫组织化学法检测结肠组织中波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及TGF-β1/丝-苏氨酸激酶3(Smad3)表达。采用t检验进行统计学分析。
结果：转基因DSS组体质量下降(9.6±1.8)%，高于野生型DSS组下降的(6.2±1.3)%，差异有统计学意义(t＝3.，P0.01)，转基因DSS组DAI评分和结肠病理评分均高于野生型DSS组[分别为(7.33±0.58)分比(6.00±1.00)分，(14.00±1.05)分比(11.75±0.50)分]，差异均有统计学意义(t＝2.、4.，P均0.05)，且Masson染色与天狼星红染色均提示肠纤维化程度加重。免疫组织化学染色结果显示，野生型DSS组小鼠波形蛋白、α-SMA、TGF-β1和Smad3的累积阳性吸光度值均低于转基因DSS组(分别为0.±0.比0.±0.，0.±0.比0.±0.，0.±0.比0.±0.，0.±0.比0.±0.)，差异均有统计学意义(t＝6.、9.、7.、10.，P均0.01)。
结论：TL1A可能通过激活TGF-β1/Smad3通路促进肠成纤维细胞的活化与增殖，导致实验性结肠炎相关肠纤维化的发生、发展。
肠纤维化的发生是一个复杂、动态的过程，目前认为是在易感基因基础上出现了肠黏膜免疫失衡，释放的多种炎症因子和生长因子激活肠道间质细胞进而产生胶原等细胞外间质(extracellularmatrix,ECM)成分过度沉积，最终导致肠纤维化[1]。在肠纤维化形成过程中最主要的效应细胞是肠成纤维细胞(intestinalfibroblasts,IFB)，其活化与增殖的标志物为α平滑肌肌动蛋白(alphasmoothmuscleactin,α-SMA)和波形蛋白(vimentin)，当IFB活化和增殖增强时，合成与分泌ECM的功能也增强[2]。通常情况下，成纤维细胞不表达α-SMA，但其在细胞因子等刺激因素作用下将发生活化，α-SMA与胶原合成的功能均增强[3]。其中，TGF-β1/丝-苏氨酸激酶(Smad)信号转导通路对IFB活化及产生效应起主导作用。研究显示，肠道炎症发生过程中TGF-β1/Smad3通路的激活，可导致Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原沉积[4]。
作为肠道炎症反应的中心环节，CD4＋T淋巴细胞在调控体内免疫应答和维持免疫平衡稳定中发挥重要作用。Th包括Th1、Th2和Th17等细胞亚群。Th1主要分泌干扰素-γ，Th17主要分泌IL-17。肿瘤坏死因子样配体1A(tumornecrosisfactorligand-relatedmolecule1A,TL1A)可通过影响肠黏膜T淋巴细胞的活化、增殖，促进Th1的极化和效应功能，上调干扰素-γ的表达，从而促进肠黏膜的炎症反应和纤维化[5]。同时，TL1A还可作用于Th17使其分泌IL-17增加，导致肠黏膜免疫失调引发肠道炎症反应，慢性炎症反应是肠纤维化发生的首发因素，炎症反应可进一步激活IFB的活化，产生大量ECM，以致肠纤维化形成。TL1A在结肠炎相关肠纤维化的发生中可能有重要作用。对象与方法
一、实验动物
野生型C57BL/6小鼠16只，体质量为20～22g，鼠龄为8～10周，清洁级，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为。淋系细胞高表达TL1A(L-Tg转基因)小鼠16只，体质量为20～22g，鼠龄为8～10周，清洁级，种鼠由美国加利福尼亚州雪松西奈山医学中心洛杉矶席徳IBD和免疫生物研究所赠予，后期由医院养殖繁育并进行鉴定。
二、实验分组及慢性实验性结肠炎相关纤维化小鼠模型的建立
将16只野生型C57BL/6小鼠分成野生型对照组和野生型右旋葡聚糖硫酸钠(dextransodiumsulfate,DSS)组[6]，每组8只；将16只TL1A转基因小鼠分成转基因对照组和转基因DSS组，每组8只；DSS购自美国MPBiomedicals公司。对照组小鼠饮用蒸馏水；DSS组小鼠分别在1～5、8～12、15～19、22～26d饮用2%DSS，其余时间均饮用蒸馏水；第29天处死小鼠，并迅速分离末端回肠至直肠，用4℃PBS冲洗3次，对大体标本摄片，留取约5mm肠组织，以4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋并切片。
三、小鼠一般情况和疾病活动指数(diseaseactivityindex,DAI)的评估
每天观察小鼠的进食情况、体质量变化、粪便性状、精神状态、毛发光泽程度、活动情况等。以DAI评分标准[7]评估小鼠的粪便性状、每日体质量和粪便隐血情况，并记录评分。
四、结肠炎症程度和肠纤维化程度的评估
采用H-E染色观察结肠组织学损伤，并参照Cooper等[8]评分标准进行结肠组织病理学评分。采用Masson染色和天狼星红染色评估胶原沉积情况，采用免疫组织化学法检测α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1/Smad3在小鼠结肠组织中的表达，免疫组织化学染色显示胞质出现棕色颗粒为阳性表达，计算累积阳性吸光度值。
五、统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。
结果
一、慢性实验性结肠炎相关纤维化小鼠一般情况和结肠炎症情况
与野生型对照组相比，野生型DSS组小鼠体质量下降[(25.2±0.2)g比(22.2±0.3)g]，差异有统计学意义(t＝2.，P0.05)；与转基因对照组相比，转基因DSS组小鼠体质量下降[(24.7±0.4)g比(20.0±0.1)g]，差异有统计学意义(t＝3.，P0.05)；转基因DSS组小鼠体质量下降的程度高于野生型DSS组[(9.6±1.8)%比(6.2±1.3)%]，差异有统计学意义(t＝3.，P0.01)。转基因DSS组DAI评分高于野生型DSS组[(7.33±0.58)分比(6.00±1.00)分]，差异有统计学意义(t＝2.，P＝0.02)。见图1，野生型DSS组小鼠结肠肠壁增厚，与野生型对照组相比，野生型DSS组小鼠结肠长度缩短[(7.8±0.8)cm比(6.5±0.6)cm]，差异有统计学意义(t＝2.，P0.05)；与转基因对照组相比，转基因DSS组小鼠结肠长度缩短[(7.7±0.6)cm比(5.6±0.5)cm]，差异有统计学意义(t＝2.，P0.05)；与野生型DSS组相比，转基因DSS组小鼠的结肠长度缩短程度更明显[(5.6±0.5)cm比(6.5±0.6)cm]，差异有统计学意义(t＝2.，P0.05)。见图2，H-E染色结果显示，与野生型对照组相比，野生型DSS组小鼠的结肠可见黏膜缺失，浅溃疡形成，腺体被破坏或消失，杯状细胞减少，黏膜和黏膜下层可见水肿，中性粒细胞和淋巴细胞浸润，结肠病理评分较高[0分比(11.75±0.50)分]，差异有统计学意义(t＝7.，P0.01)；与转基因对照组相比，转基因DSS组小鼠结肠病理评分较高[0分比(14.00±1.05)分]，差异有统计学意义(t＝8.，P0.01)；与野生型DSS组相比，转基因DSS组小鼠肠黏膜缺失、腺体被破坏、炎症细胞的浸润较明显，结肠病理评分较高[(11.75±0.50)分比(14.00±1.05)分]，差异有统计学意义(t＝4.，P0.01)。
二、慢性实验性结肠炎相关纤维化小鼠结肠纤维化情况
见图3，Masson染色结果显示，与野生型对照组相比，野生型DSS组小鼠结肠纤维化程度加重，累积阳性吸光度值较高(0.±0.比0.±0.)，差异有统计学意义(t＝4.，P0.01)；与转基因对照组相比，转基因DSS组小鼠结肠纤维化程度加重，累积阳性吸光度值较高(0.±0.比0.±0.)，差异有统计学意义(t＝5.，P0.01)；与野生型DSS组相比，转基因DSS组小鼠肠道纤维化程度更重，累积阳性吸光度值较高(0.±0.比0.±0.)，差异有统计学意义(t＝3.，P0.05)。见图4，天狼星红染色结果显示，与野生型对照组小鼠相比，野生型DSS组小鼠结肠纤维化程度加重，累积阳性吸光度值较高(0.±0.比0.±0.)，差异有统计学意义(t＝3.，P0.05)；与转基因对照组相比，转基因DSS组小鼠结肠纤维化程度加重，累积阳性吸光度值较高(0.±0.比0.±0.)，差异有统计学意义(t＝3.，P0.05)；与野生型DSS组相比，转基因DSS组小鼠肠道纤维化程度更重，累积阳性吸光度值较高(0.±0.比0.±0.)，差异有统计学意义(t＝3.，P0.05)。见图5，免疫组织化学染色结果显示，野生型DSS组小鼠Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的累积阳性吸光度值均低于转基因DSS组小鼠(分别为0.±0.比0.±0.，0.±0.比0.±0.)，差异均有统计学意义(t＝8.、16.，P均0.01)。
图4各组小鼠结肠纤维化情况，天狼星红染色低倍放大
A野生型对照组 B野生型DSS组 C转基因对照组 D转基因DSS组
图5各组小鼠结肠胶原纤维沉积情况免疫组织化学染色中倍放大
A野生型对照组Ⅰ型胶原 B野生型DSS组Ⅰ型胶原C转基因对照组Ⅰ型胶原 D转基因DSS组Ⅰ型胶原 E野生型对照组Ⅲ型胶原 F野生型DSS组Ⅲ型胶原 G转基因对照组Ⅲ型胶原 H转基因DSS组Ⅲ型胶原
三、慢性实验性结肠炎相关纤维化小鼠结肠成纤维细胞活化情况及小鼠结肠组织TGF-β1/Smad3的表达情况
见图6，免疫组织化学染色结果显示，野生型DSS组小鼠波形蛋白、α-SMA、TGF-β1和Smad3的累积阳性吸光度值均低于转基因DSS组(分别为0.±0.比0.±0.，0.±0.比0.±0.，0．±0.比0.±0.，0.±0.比0.±0.)，差异均有统计学意义(t＝6.、9.、7.、10.，P均0.01)。
图6慢性实验性结肠炎相关纤维化小鼠结肠成纤维细胞活化及TGF-β1/Smad3的表达，免疫组织化学染色中倍放大
A野生型对照组波形蛋白 B野生型DSS组波形蛋白 C转基因对照组波形蛋白 D转基因DSS组波形蛋白 E野生型对照组α-SMA F野生型DSS组α-SMA G转基因对照组α-SMA H转基因DSS组α-SMA I野生型对照组TGF-β1 J野生型DSS组TGF-β1 K转基因对照组TGF-β1 L转基因DSS组TGF-β1 M野生型对照组Smad3 N野生型DSS组Smad3 O转基因对照组Smad3 P转基因DSS组Smad3
讨论
目前认为，IBD相关肠纤维化的发生机制是在易感基因基础上，大量炎症细胞释放促炎因子，引起肠道的慢性炎症，使肠道持续处于损伤和修复并存的状态[2]，导致肠壁以胶原为主的ECM在肠组织过度合成和异常沉积，最终形成肠纤维化，表现为肠狭窄或肠梗阻等严重的并发症。
TL1A是新近发现的一种肿瘤坏死因子家族成员，是IBD的易感基因。TL1A通过与肿瘤坏死因子受体超家族成员死亡受体3(deathreceptor3)结合，刺激T淋巴细胞的激活，促进Th1和Th17等细胞的活化与效应功能，参与肠道炎症反应[9]。目前，有关TL1A调控IFB活化的机制尚鲜有相关报道。有关肝纤维化的研究发现，IL-17可通过上调TGF-β促进肝星状细胞的活化，促进肝纤维化的发生、发展[10]。TL1A作为调控Th的关键因子，可促进CD4＋T淋巴细胞分化为Th1和Th17，分泌大量的促炎因子干扰素-γ和IL-17，参与IBD的发生。在T淋巴细胞转移和DSS诱导的慢性结肠炎小鼠模型中发现，TL1A可通过上调肠相关淋巴样组织中CD4＋T淋巴细胞的干扰素-γ和IL-17表达，增强Th1和Th17的效应功能，促进肠黏膜炎症和纤维化发生[11,12]。IBD患者结肠肠黏膜固有层中单个核细胞中的TL1A表达升高，且与炎症的严重程度呈正相关[13]。有学者通过用TL1A抗体干预后，发现其在缓解肠道炎症的同时减轻了纤维化程度，提示TL1A在结肠炎症反应中有促炎、促纤维化作用，且可能抑制IFB增殖与活化，减少胶原合成的同时增加胶原分解[14]。本研究发现，饮用DSS后，与野生型小鼠相比，转基因小鼠体质量下降更明显，DAI评分和病理评分升高更明显，结肠长度缩短更明显，证明TL1A过表达促进了慢性实验性结肠炎小鼠的肠道炎症反应。通过Masson染色和天狼星红染色观察DSS诱导的小鼠结肠炎中肠道胶原纤维的改变，发现野生型DSS组和转基因DSS组小鼠，与野生型小鼠相比，结肠不仅出现了炎症的改变，在黏膜和黏膜下层出现胶原蛋白的沉积，胶原染色的面积明显增多，而且转基因小鼠病变程度更严重，同时转基因小鼠的结肠Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达与野生型小鼠相比明显增加，表明TL1A在促进结肠发生炎症的同时，也会促进胶原的合成与过度沉积，进而在肠纤维化的发生、发展中有重要作用。
ECM有效的诱导因子之一TGF-β1在肠纤维化中表达明显上调。在纤维化进程中，IFB的活化与增殖明显增强，其活化、增殖的标志物波形蛋白和α-SMA表达上调，且合成与分泌ECM的功能增强。静止状态下成纤维细胞不表达α-SMA，但可被炎性因子和细胞因子等激活，而活化的成纤维细胞表达α-SMA及合成胶原增加是肠纤维化的主要效应细胞。在正常情况下，成纤维细胞主要位于黏膜下层、浆膜层和肌间结缔组织；肠道发生纤维化时，黏膜下层与黏膜肌层的成纤维细胞明显增多[15]。通过对IBD患者肠狭窄部位的肠成纤维细胞进行体外培养也发现，肠成纤维细胞活化能力增强[16]。IBD发病过程中肠道炎症损伤也为IFB活化提供了启动条件。本研究结果亦显示，与野生型DSS组小鼠相比，转基因DSS组小鼠结肠黏膜下层的波形蛋白和α-SMA的表达均明显增加。与野生型DSS组小鼠相比，转基因DSS组小鼠结肠黏膜下层的TGF-β和Smad3的表达明显增加。TL1A可能通过激活TGF-β1/Smad3通路，促进IFB的增殖与活化，参与慢性实验性结肠炎相关肠纤维化的发生。
参考文献：略
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