推荐理由
肠道菌群是近年来研究的热门领域，与多种疾病的发生发展相关。中药成分复杂，多数有效成分口服生物利用度低，因此不可避免地与肠道菌群发生相互作用，成为中药作用的重要靶标。本综述于年9月发表于ProteinCell杂志，IF10.，文中系统介绍了中医药与肠道菌群结合的研究思路及研究进展，可供大家借鉴。上一期介绍了综述的上半部分，本期将继续进行后半部分的解析，主要内容为肠道微生物如何影响中药的药效、中药如何改变肠道微生物结构及功能，以及中药与肠道微生物群结合的研究套路。
基本信息
标题：RoleofgutmicrobiotainidentificationofnovelTCM-derivedactivemetabolites
期刊：ProteinCell
发表日期：年9月15日
肠道微生物在中药多糖发酵中的作用
中药多糖以及蔬菜、水果和全谷物等其他植物来源的多糖，在免疫调节和疾病改善中发挥着重要的作用。例如，从人参制备的高分子量（kDa）和低分子量（kDa）以及中性和酸性多糖，均表现出调控细胞和宿主生理的不同功能。由于人类基因组编码的消化酶有限，多糖在到达结肠前通常是不被消化的。在结肠中，肠道微生物通过其糖酵解机制将可发酵的多糖（例如β-葡聚糖）分解，从而产生重要的天然生物活性产物。多糖的连续消化导致产生了许多短链寡糖，包括不同的链长、结构组成和分支数。这些变化的寡糖可以促进双歧杆菌属和拟杆菌属等益生菌的生长。较短的多糖可以进一步消化形成单糖，如甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）和岩藻糖（Fuc），它们可以促进细菌的生长。单糖可以连续分解代谢形成代谢产物，例如短链脂肪酸（SCFA）（甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐）、乳酸盐、氢和二氧化碳，这可能直接影响宿主生理。另一方面，降解产物如D-甘露糖可能充当信号分子，对宿主细胞和组织表现出不同的免疫调节作用和功能。
肠道微生物参与来自中药的多糖降解。例如，丁酸盐的生产涉及许多细菌物种，包括普拉梭菌、直肠真细菌、罗斯氏菌、梭状芽胞杆菌以及其他许多属于拟杆菌科的菌种。这些功能性细菌的特征是表达数种至数十种用于针对特定糖苷键或化学取代基的降解多糖的酶。参与各种多糖的结合、降解和引入，包括拟杆菌属中的杂多糖利用位点（PUL）或淀粉利用系统（Sus）样系统。对碳水化合物活性酶（CAZymes）而言，拟杆菌属降解的多糖相对广泛，而厚壁门菌属则倾向于分解代谢特定的多糖。许多不同的细菌可能涉及多糖的逐步降解。功能宏基因组学研究正在深入探索参与多糖代谢的菌群。
中药调控肠道微生物群的氨基酸代谢
膳食蛋白质包括来自中药、食品和其他营养食品的蛋白质，均可被宿主和肠道微生物消化，这可能会进一步影响肠道微生物群的结构。同时，远端结肠中的某些肠道细菌也通过特定的生化途径代谢氨基酸，形成独特的功能性代谢产物。产生的代谢中间产物可能涉及能量平衡、营养代谢、肠道健康、免疫的最佳调节，或引起炎症和疾病。通常，氨基酸的脱氨基导致氨的产生，而脱羧导致胺的产生。摄入的蛋白质量会改变结肠中产生的细胞毒素、基因毒素物质和致癌物相关的氨、微量胺和气体（甲烷、氢、硫）的浓度。这些有害的代谢物可能会穿过肠道屏障，并进入血液进行系统性循环，从而导致疾病发展。
细菌对半胱氨酸和甲硫氨酸的厌氧发酵导致H2S的形成。结肠中长期增加的硫化物和氨浓度可促进结肠炎和肿瘤发生。此外，芳香族氨基酸的代谢也可能产生一组尿毒症毒素，包括硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐、马尿酸、硫酸苯酯、硫酸邻苯二酚、4-乙基苯基硫酸盐、对甲酚葡糖醛酸苷和牛尿酚7-葡糖醛酸苷。这些化合物与建立肠道-血浆-肾脏代谢轴的慢性肾脏病（CKD）的发展密切相关。此外，“酪氨酸”的降解会产生儿茶酚胺和苯酚，据称对甲酚、对亚硝基苯酚和对重氮醌显示出致癌作用，酪胺与高血压有关，多巴、多巴胺和去甲肾上腺素可调节多种生理功能。另一方面，“色氨酸”的厌氧转化也产生与肠-脑轴（GBA）有关的功能性代谢产物。这些包括神经活性代谢物，例如5-羟色胺、褪黑激素、犬尿氨酸、喹啉酸酯、吲哚、IAA、IPA和色胺酸。由于宿主和菌群之间的紧密相互作用，还合成了其他神经活性分子，包括组胺酸、谷氨酸和GABA。参与这种代谢过程的肠道细菌被广泛地分为五个门，包括放线菌、厚壁菌、拟杆菌、变形菌和梭杆菌，其中梭菌属、伯克霍尔德菌属、链霉菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属进一步富集，参与了许多色氨酸代谢途径。
支链氨基酸（BCAA），例如亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val），既是含氮化合物合成代谢的基质，又是通过多种信号网络调节能量稳定的信号分子，包括磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的哺乳动物靶标（PI3K/AKT/mTOR）通路。肠道微生物群也参与BCAA的发酵，并生成代谢产物的复杂混合物，包括氨、SCFA和支链脂肪酸（戊酸酯、异丁酸酯和异戊酸酯）。这些细菌代谢物可影响宿主的正常粘膜免疫。
通常，参与氨基酸代谢的肠道微生物群的丰富度经常受所使用的中药影响。这些包括人类小肠中的梭状芽胞杆菌簇、芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌和变形菌，以及健康人大肠中的梭状芽胞杆菌和肽链球菌。预计会有越来越多的细菌被发现与蛋白质代谢有关。因此，揭示蛋白质/氨基酸发酵途径，发现肠道微生物群产生的潜在新代谢产物，以及探索中药对肠道微生物的调节作用至关重要。
中药调控肠道微生物的脂质代谢
脂质及其衍生的功能代谢产物在宿主中发挥多种生理作用。中药和日常食物摄入的脂质，还会影响肠道微生物的生长和组成，而肠道微生物群细菌也是宿主脂质代谢的重要参与者。除SCFA外，肠道中的细菌还会产生许多其他源自脂质代谢的功能性代谢产物。例如，包括罗斯氏菌、乳杆菌、丁酸弧菌和巨球形菌在内的共生细菌参与脂肪酸代谢，产生一系列复杂影响宿主生理的共轭必需脂肪酸（例如共轭亚油酸）。另一方面，乳脂会增加牛磺酸与胆汁酸的结合，从而导致沃氏嗜胆菌进一步生长，氨基酸来源的硫产生H2S增加，这与结肠炎的发生密切相关的。
利用三甲胺（TMA）合成途径的关键酶成分，例如胆碱TMA裂解酶（CutC）途径和肉碱加氧酶（CntA）途径，肠道细菌，如梭状芽孢杆菌XIVa菌株和真细菌，能将胆碱和L-肉碱分解代谢生产TMA。TMA在肝脏中转化为氧化三甲胺（TMAO）。许多研究表明TMAO血浆水平与动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）的风险密切相关。
以往研究明确了肠道阿克曼氏菌、Butyricimonas、Christensenellaceceae、Eggerthella、Teneercutes和Pasteurellaceae等菌在调控脂质代谢和/或不同类别的脂蛋白方面的特定作用。同时，在阐明中医介导的脂质代谢调节和疾病缓解的潜在机制方面，也已取得了迅速的进展。例如，有研究显示TCMs抑制脂质的肠道吸收，减少其从头生物合成，增加分解代谢和分泌。中药给药后改变的肠道微生物群组成可能有助于改善脂类代谢异常。另一方面，人参提取物可增加粪肠球菌，从而产生不饱和长链脂肪酸肉豆蔻酸（MA），从而通过刺激棕色脂肪组织（BAT）和形成米色脂肪而减少肥胖。因此，中药对肠道微生物群的调节可能产生最佳量的有益脂质代谢产物，这是促进宿主健康的有效策略。
中药小分子的肠道微生物转化
不同的中药复方均包含一系列具有多重生物学功能的小分子化合物，包括类黄酮、皂苷、生物碱和蒽醌等。肠道微生物群和肝脏都涉及外源性成分的代谢转化。在肠道中，这些成分可以通过肠道微生物进行修饰/结合。或被吸收并运输到肝脏后，被修饰/结合以增加其水溶性并促进排泄。从肝脏排泄到肠道后，这些代谢物可能会进一步通过肠道微生物群进行修饰/早期解离以形成次级代谢物。许多转化的代谢物通常为功能性化合物，直接影响中医治疗的疗效。例如，中药成分中经常鉴定出的草药皂苷如皂角苷、栀子苷、环烯醚酮苷和黄酮苷被细菌β-葡萄糖苷酶（GUS）代谢为次级糖苷或糖苷配基。此类转化可能会影响这些分子的生物利用度和生物活性。此外，由多种属于厚壁菌门（60％）和拟杆菌门（21％）的肠道细菌编码的肠道微生物GUS酶也催化β-D-葡萄糖醛酸从它们的结合化合物中分离出来，影响药物的效力和毒性。以人参提取物的转化为例。口服后，人参提取物中的人参皂甙Rb1，Rb2和Rc通过肠道微生物群转化而形成20-O-β-D-吡喃葡萄糖基20（S）-原托那沙糖醇（化合物K），其被吸收到血液中以达到药理作用。与人参皂苷Rb1相比，化合物K表现出更强的抗肿瘤、抗炎和抗过敏活性。因此，肠道微生物群在口服人参的药理作用中起重要作用。
另一个例子是CPT-11，它是一种有效抗癌剂，在体内被代谢为活性化合物SN-38。患者体内平衡的SN-38浓度对于维持最佳的癌症治疗效果同时降低毒性至关重要。有趣的是，中药成分和肠道微生物群都参与了SN-38活性的调节。为了排毒，SN-38通过UDP-葡糖醛酸糖基转移酶（UGT）被转化为SN-38-葡糖醛酸。然而，去除糖苷糖基的纯化草药苷元抑制了UGT活性，导致肠肝循环中的毒性SN-38浓度增加。另一方面，肠道微生物群细菌也使用gus编码的β-葡糖醛酸苷酶对SN-38-葡糖醛酸苷进行解偶联。因此，潜在的调节活动形成了一个复杂的监管网络。如何在具有最大癌症治疗功效的患者中实现SN-38的活性与毒性平衡是一个重要的问题。
肠道微生物群还可以转化胆汁酸和胆固醇，产生各种功能性代谢产物。其中，胆汁酸以甘氨酸、牛磺酸或硫酸盐结合物的形式在肝脏中产生，并在分泌入肠道后被肠道细菌解离和修饰。通过与胆汁酸核受体FXR和G蛋白偶联胆汁酸受体1（TGR5）相互作用，胆汁酸信号传导控制了多种重要的生理行为并维持了肠道的稳态和健康的环境。拟杆菌、双歧杆菌、梭菌、埃克氏菌、大肠埃希菌、真细菌、梭杆菌、乳杆菌、李斯特菌、肽球菌、肽链球菌、假单胞菌和鲁米诺球菌等细菌，可将其酶用于胆汁酸的解离、氧化和差向异构化、7-脱羟基化、酯化和脱硫。因此，在肠道细菌发酵后会产生或有肿瘤促进作用的次级胆汁酸。因此，有必要开发使用中药的疾病治疗策略，或使用代谢工程细菌，修饰化学物质以维持健康。
基于菌群的整合多元组学研究——中药研究的方向
由于中药研究中遇到的困难，必须考虑开发新的策略来表征中药相关的活性成分。对于未来的中药来源的药物研究，使用基于微生物的整合多组学平台似乎至关重要。其基本原理如下：不是直接从草药提取物中筛选功能成分，而是使用多组学方法通过肠道微生物发酵转化后鉴定功能成分。首先将准备好的中药产品（例如粗提取物/汤剂或散剂）喂给动物，以评估其改善疾病的功效。如果获得阳性结果，则随后对肠/粪便/血液样本中细菌的分类和丰度及其衍生代谢产物（包括含有潜在类生元的细菌结构成分）进行定量。在对照组和实验组之间显示出统计学差异的细菌和代谢物可能与所讨论疾病的治疗功效有关，因此将其确定为潜在靶标。然后，将对这些细菌（潜在的益生菌）或化合物（潜在的后生元或类生元）单独或在一个联合体中进行功能和机制的系统评估。为此，将使用例如二代测序（NGS）、蛋白质组学和代谢组学之类的尖端分析平台。
基于菌群的中药组学研究的实验设计描述如下：（i）在制备中药汤等中药产品时，请严格遵循说明进行操作。（ii）对动物和人类进行分组，然后观察疾病的进程及发展，最后通过统计学评估结果。（iii）分别通过16SrRNA基因测序或宏基因组学，对肠道微生物群的组成和/或其预测的肠道微生物组功能进行分析，然后对操作分类单位（OTU）和其他功能性DNA片段进行生物信息学分析。（iv）通过代谢组学结合其他分析方法对代谢产物进行分析，例如宏代谢组学（针对肠道微生物群）和表观遗传学、转录组学/单细胞RNA测序（scRNAseq）和蛋白质组学（针对宿主）。这种多组学方法将与传统的免疫学、生理学和病理学分析协同工作，以获得整体结果。（v）分析从对照组和实验组获得的数据集之间的关联，以识别具有显著差异的参数。通过GO和KEGG途径分析可以建立潜在的增加或减少的生化途径。此外，一些与中医和肠道微生物群研究有关的数据库，包括中医网、中医综合症、中药综合数据库（TCMID）、化合物参考数据库（CRD）和HIT，以及病原体宿主数据库（PHI-base和EHFPI）可用以作为中药药理网络分析系统的参考。（vi）分离选定的微生物菌群并纯化或合成新的功能性代谢物，以进一步评估或验证其安全性和有效性。（vii）根据获得的结果，评估进一步临床试验的可能性。
更重要的是，在菌群发酵中药成分后，只有参与信号传导途径调节和疾病改善的重要元素会被突出出来。然后选择这些要素以开发新的治疗策略。当前，有许多基于多组学的模板可以作为中医药和微生物群相关研究的参考。例如，对肠道微生物群生态系统进行功能分析以更好地了解炎症性肠病（IBD），而改进的ColPortal平台则将多组学研究整合到了了解炎症性肠病（IBS）疾病模型中的菌群与代谢组学之间的关系。本实验流程具有发现基于中药的全新益生元、益生菌和益生素来治疗疾病的潜力。
展望
最近的研究表明，肠道微生物群参与食物和营养物质的代谢，并在将原始中药成分转化为功能性代谢产物中发挥核心作用。中药的代谢和经肠道微生物转化被逐渐揭示，结合前沿的多组学研究工具（如NGS和代谢组学平台）以及先进的生物信息学分析、数据库和算法，使得发现全新的有效代谢物成为可能。同时，更好地了解中医药发挥功能的分子机制，将为有效治疗慢性炎症相关疾病做出巨大贡献。
总结
下半部分主要介绍了肠道微生物在中药的转化、中药在调控肠道微生物氨基酸、脂质代谢中的作用，并介绍了利用多组学技术系统研究中药与肠道菌群互作治疗疾病的研究套路，为中医药-肠道菌群研究提供了规范性的指导。
研究套路总结如下：
第一步：严格做好中药的质量控制
第二步：实验干预，评估疗效
第三步：肠道菌群检测及分析
第四步：代谢物分析
第五步：差异菌群、差异代谢物、差异功能分析
第六步：差异菌群、差异代谢物的功能验证
第七步：临床疗效检验
一般来说，做完前三步，可以发2-3分，做到第五步差不多是3-5分的档次，如果有第六步甚至第七步，发到顶刊也不成问题啦。后续的推文我们将按分值介绍各个档次的中药-微生物研究的套路。
中医科研不易，戴着镣铐也能跳舞！
中西科研君
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