原文出处：PraveschotinuntP,Duraj-ThatteAM,GelfatI,BahlF,ChouDB,JoshiNS.EngineeredE.coliNissleforthedeliveryofmatrix-tetheredtherapeuticdomainstothegut.NatCommun.，10(1):.
研究背景
炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease，IBD)是一种可引起肠道慢性炎症反应的自身免疫性疾病。其发病与免疫失调、遗传易感性以及菌群失调等多种因素相关，然而，这些因素间复杂的相互作用阻碍了IBD治疗进展。传统的IBD治疗方法依赖于药物干预，通过减少粘膜损伤处细菌感染来抑制炎症反应。IBD突发后果严重，并且会随时间进展的而加重，大部分溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者需要通过手术切除部分胃肠道。因此，缓解并维持疾病现状是治疗IBD的长期目标。
有研究表明，靶向肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）可有效治疗IBD，表明生物制剂在治疗重症IBD方面有很好应用前景。然而，由于种族或环境因素（如饮食，社会行为等）不同，新型疗法研究进展缓慢，一些药物在动物模型中具有很好的治疗效果而在临床上却无显著作用。对于这种个体差异性疾病，需要联合治疗或针对病人制定相应治疗方案才能取得有效的治疗效果。
IBD发生时，胃肠道黏膜屏障被破坏，肠道暴露在细菌等有害物质中，因此恢复粘膜屏障、维持肠道上皮完整性是治疗IBD的关键。肠道上皮粘膜可通过修复和再生的过程愈合，完全再生依赖于干细胞增殖与分，其过程较慢化，而修复可在损伤后数小时内进行，主要依赖于上皮细胞从周围区域迁移到伤口处发挥作用，保护肠道免受细菌和外来抗原的侵袭，防止炎症进一步加重。由于临床研究中很难直接监测肠道上皮修复结果，大部分IBD和溃疡性结肠炎治疗方法聚焦于炎症通路，为粘膜愈合治疗指明方向。
近年来，肠道菌群成为治疗IBD的新兴领域，菌群的多样性与IBD的程度负相关。大部分微生物可以通过受损伤的肠道上皮进入固有层，加重IBD相关炎症。既往研究表明，未经修饰的益生菌临床应用效果并不显著，主要因为其效力低、在胃肠道中无法持续存在等原因导致。因此，工程化微生物由于其可以在结肠局部分泌生物药物（如IL-10、TNF）等原因越来越受到人们重视。以上研究在动物模型中效果显著，但在临床上尚未成功，主要由于生物分子难以在发病部位长时间维持较高浓度。
本研究中，作者提出一种新的促进粘膜愈合方法，即工程化微生物疗法。通过重编程的方法，使细菌在肠道中能够自组装形成一种具有抗炎结构域的多价物质。此结构域可以靶向粘膜上层，并且促进宿主增强上皮屏障功能。细菌产生的生物活性成分连接于curli纤维上，curil纤维是细菌外一种常见的蛋白质。因此作者将这种方法称之为益生菌相关的治疗性卷曲菌毛杂交（Probiotic-associatedtherapeuticcurlihybrids，PATCH）,并证实PATCH能够减轻葡聚糖硫酸钠（Dextransodiumsulfate，DSS）诱导的小鼠结肠炎。
研究结果
结果一：益生菌相关的治疗性卷曲菌毛杂交
作者使用大肠杆菌Nissle（EcN）作为PATCH的实验菌株，因为EcN对人体无害，并且适用基因工程操作，是工程化微生物的最佳选择。EcN除了作为胃肠道疾病补充药物外，还可以缓解溃疡性结肠炎，虽然对人体有利，但总体疗效较低，并且复发率高，所以未能成为治疗IBD的有效方法。EcN是一种兼性厌氧菌，主要存在于结肠，可在炎症所致的高氧环境中大量繁殖，成为其作为工程化细菌的主要优点。
人类细胞因子—三叶因子（Trefoilfactor，TFF）家族，是由胃肠道和其他粘膜表面细胞分泌的7-12kDa小蛋白，主要用于促进上皮修复，还具有抗肿瘤、抑制细胞凋亡和增强生物屏障活性等功能，但具体机制仍不明确。本实验作者将TFFs作为生物活性物质连接在curli纤维上。有研究表明，TFFs可用于IBD的治疗，但口服给药效果并不显著，大部分TFF被黏附在小肠的粘液层，为了解决这一问题，作者在回肠、盲肠、结肠产生TFF后，将它们与curli纤维基质相连。
结果二：工程化EcN可分泌TFF并使其进行自组装
为建立PATCH体系，作者设计一种可与三种TFF（TFF1-3）相融合的curli纤维（CsgA）单体基因。TFF通过内含6xHIS标签的柔性甘氨酸-丝氨酸接头与CsgA的C末端相连，作者先前已证实这种连接方式不会干扰TFF细胞外分泌和自组装。编码CsgA-TFF融合蛋白的全部基因与curli纤维分泌与自组装所必须的其它基因（CsgB、CsgC、CsgE、CsgF、CsgG）共转录，形成一个curli合成操纵子，该操纵子被置于带有卡那霉素选择性标记的pBbB8k质粒中可诱导启动子（PBAD）的下游。由于EcN染色体中curli基因在生理温度和渗透压下表达下调，因此curli操纵子中需加入可提高curli分泌的基因。作者使用一种curli基因敲除的EcN突变体（PBP8）作为对照，以排除自身curli基因的影响。
为证实工程化EcN能够产生可融合TFFs的curli纤维，作者使用人工合成的curli质粒转化EcN，并用编码GFP的基因代替curli基因作为阴性对照。转化的细胞培养在37℃下高渗培养基中，以模拟体内生理条件，并用L-（+）-阿拉伯糖进行诱导。对curli纤维进行刚果红定量分析，实验结果表明野生型CsgA和三种TFF-CsgA融合蛋白与对照组相比均可表达并进行自组装（图2.A）。细胞ELISA实验检测6xHIS标签，结果进一步证实其可进行细胞外组装（图2.B）。使用扫描电子显微镜对EcN进行扫描，结果显示重组wt-CsgA和三种TFF-CsgA融合蛋白可组装成类似于天然curli纤维结构（图2.C-G）。为了进一步证实TFF3成功表达，作者进行ELISA实验，结果表明与对照组以及wt-CsgA相比，实验组TFF3表达量最高（图2.H）。以上结果表明，工程化EcN可分泌TFF并使其进行自组装。
结果三：工程化EcN不具有致病性
以往实验证实，大肠杆菌产生的CsgA-TFF3融合蛋白可以与黏蛋白结合，并且可在人结肠癌细胞（Caco-2）构建的体外模型中促进细胞的迁移。在进行体内实验前，作者想验证工程化的EcN过表达curli纤维是否会诱导PBP8产生致病表型。因此，作者对与细菌共培养的Caco-2细胞进行侵袭、迁移实验，结果表明与对照组相比，实验菌株对Caco-2细胞侵袭能力无显著影响（图3），与阳性对照组鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium，SL）相比，实验菌株对Caco-2细胞侵袭能力显著下降（图3.A）。对Transwell小室基底侧进行细菌异位实验，结果如预期所示，未见EcN衍生菌株易位（图3.B）。将荧光标记的右旋糖苷与细菌共孵育24小时后，加入到Transwell小室底部，易位实验检测屏障功能，结果显示，未见EcN衍生菌株易位，而阳性对照组细菌易位显著（图3.C）。作者将Caco-2细胞作为肠道粘膜上皮的体外模型，检测肠道上皮细胞对工程化EcN的反应性，包括促炎信号级联反应的激活及IL-8等细胞因子的释放等，将细菌与Caco-2细胞共处理24小时，结果显示EcN与PBP8菌株处理IL-8的产生无显著差异，而SL处理的细胞与未用细菌处理的细胞相比IL-8表达量增加四倍（图3.D）。以上结果表明，与未修饰的EcN相比PBP8、wt-CsgA和CsgA-TFF3菌株不会损伤肠道上皮完整性。
结果四：工程化EcN在体内的定植及curli的表达
作者想通过体内实验验证工程化EcN对小鼠进行灌胃处理后，菌株在肠道中的活性与定植能力。本实验作者采用一种具有发光操纵子（luxABCDE）的EcN菌株进行体内示踪，将具有curli操纵子的质粒转化到EcN中后，使用转化后的EcN对健康小鼠进行灌胃处理，同时在饮用水中加入卡那霉素和L-（+）-阿拉伯糖对转化的EcN进行筛选并诱导curli的表达。对小鼠粪便样品进行CFU平板计数，结果显示，除EcN-CsgA-TFF1菌株外所有菌株在小鼠胃肠道内定植时间均超过32天，并且EcN-wt-CsgA菌株与EcN-GFP对照菌株平板计数结果无差异（图4.A），由此表明，体内野生型curli纤维过表达不会影响工程化EcN定植能力。EcN-CsgA-TFF2和EcN-CsgA-TFF3菌株浓度在实验过程中下降到-CFU，表明CsgA-TFF融合蛋白的产生可影响EcN在小鼠肠道中的定植能力，作者推测，这可能与TFF融合结构域的大小和内部二硫键形成有关。在菌株定植后第2天、第6天和第10天应用体内成像系统观察细菌在体内的发光状态，结果如预期所示，接受灌胃小鼠的腹部均可以观察到EcN的发光现象（图4.B）。接下来，作者想进一步证实工程化curli纤维是在原位产生的。使用抗6xHIS抗体对灌胃5天后粪便匀浆样品进行ELISA检测，结果如预期所示，与定植EcN-GFP菌株的小鼠相比，定植EcN-wt-CsgA和EcN-CsgA-TFFs菌株的小鼠发光信号强度显著增加（图4.C）。
实验结束后，取小鼠近端结肠和远端结肠，采用免疫组织化学方法对工程化EcN进行染色（图5）。蓝色荧光标记LPS抗体显示大肠杆菌，红色荧光标记MUC2显示黏蛋白，绿色荧光标记E-cadherin显示结肠上皮细胞，明场用于确定肠腔边界，样本固定与染色可保护肠道黏蛋白完整性。抗LPS染色结果显示与PBS对照组相比，EcN、EcN-wt-CsgA和EcN-CsgA-TFFs菌株在肠腔和粘液层定植显著。将CsgA-TFF3信号与MUC2信号共定位，表明TFF3的粘蛋白结合活性可促进工程化curli纤维对粘膜的修复。
结果五：工程化EcN可改善DSS诱导的小鼠结肠炎模型
基于以上研究，作者想验证工程化EcN在葡聚糖硫酸钠(Dextransodiumsulfate，DSS)诱导的小鼠结肠炎模型中的作用。未经修饰的EcN和乳球菌分泌的TFF对DSS诱导的结肠炎模型具有治疗效果，因此作者推测，这种治疗方法与PATCH系统的结合具有更好的治疗效果。实验采用3%的DSS对雌性C57BL/6NCr1小鼠进行灌胃处理5天以上，观察PBP8-CsgA-TFF菌株对小鼠结肠炎症的保护作用，初步结果表明，PBP8菌株灌胃处理对结肠炎无显著作用。据文献报道，DSS诱导的结肠炎在远端结肠最严重，而工程菌主要存在于盲肠和近端结肠。为避开这一缺点，作者将给药方式换为直肠给药，增加细菌与病变组织共存时间，从而发挥治疗作用。
从对小鼠进行DSS灌胃处理前三天开始，直至灌胃结束后恢复期的第五天，每天对小鼠进行直肠注射PBP8（图6.A），与未经DSS处理小鼠相比，DSS灌胃组小鼠体重减轻，疾病活动指数（Diseaseactivityindex，DAI）升高。定植PBP8-CsgA-TFF3菌株的小鼠与对照组相比体重减轻缓解，DAI减少，并在去除DSS第5天后恢复到与健康对照组相同的状态(图6.B-C)。定植EcN-GFP菌株与PBP8-wt-CsgA菌株的小鼠与未定植任何菌株小鼠相比，其差异并不显著。实验第10天处死小鼠，观察PBP8、CsgA-TFF3对DSS诱导结肠炎的影响，DSS诱导结肠炎与结肠长度缩短有关，结果发现PBP8-CsgA-TFF3组的结肠长度与健康对照组无显著差异，提示原位CsgA-TFF3的产生减轻了DSS诱导的结肠炎症。相比之下，对照组、定植PBP8和PBP8-wt-CsgA菌株小鼠的结肠长度显著变短(图6.D)。
DSS诱导结肠炎的组织学特征为免疫细胞浸润，结肠隐窝丢失、上皮损伤并累及多层组织。接下来作者应用组织学方法评估细菌定植对肠道炎症的影响，结果显示，DSS处理组的组织病理学评分均显著高于健康对照组，表明DSS有效诱导炎症产生(图6.E)。与结肠炎对照组相比，PBP8-CsgA-TFF3菌株定植组的小鼠组织病理学评分最低，隐窝结及上皮结构较完整，免疫细胞浸润减轻，结肠周围组织水肿减轻，表明PBP8-CsgA-TFF3菌株定植可减轻炎症反应(图6.F-J)。为验证PATCH系统对免疫调节和粘膜屏障的作用机制，作者收取各实验组结肠组织，对组织匀浆进行ELISA实验，检测细胞因子水平，结果发现，与结肠炎对照组相比，PBP8-CsgA-TFF3定植组结肠组织中IL-6、IL-17A和TNF-α浓度显著降低(图6K-l)。以上结果表明，工程化EcN可改善DSS诱导的小鼠结肠炎模型。
研究结论
1.对大肠杆菌Nissle（EcN）菌株进行遗传改造，使其菌毛蛋白CsgA与三叶因子TFF（能促进肠屏障功能和上皮修复的细胞因子）融合表达；
2.在体外和动物试验中证实，这些融合蛋白可被分泌到细菌外，自组装形成菌毛纤维基质，且这种EcN工程菌没有致病性；
3.小鼠模型中，从用DSS诱导结肠炎前持续施用EcN工程菌（经直肠），可减少结肠的炎症和Th17应答；
4.这种保作用与粘膜屏障功能增强，以及结肠组织中的炎症性细胞因子的表达减少有关。
校对：永平
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