近日，锐翌基因协医院在《FrontiersinImmunology》上发表研究成果《MaternalhighfatdietaltersgutmicrobiotaofoffspringandexacerbatesDSS-inducedcolitisinadulthood》。锐翌作为重要合作方，承担了该研究的16SrDNA测序以及生物信息分析工作。今天，小锐带大家一起来了解一下这篇文章的精彩内容！
文献信息
题目：MaternalhighfatdietaltersgutmicrobiotaofoffspringandexacerbatesDSS-inducedcolitisinadulthood
译名：母体高脂饮食改变子代的肠道微生态，并加重子代成年期对结肠炎的易感性
期刊：FrontiersinImmunology
发表时间：IF：5.
通讯作者：王邦茂曹海龙
第一作者：谢润祥孙悦
通讯单位：医院
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研究背景
IBD是一种由免疫介导的慢性肠道疾病，研究表明高脂饮食与IBD的发生密切相关。然而对于母体高脂饮食如何影响下一代的结肠炎易感性以及潜在的致病机制知之甚少。本文采用16SrDNA测序分析方法分析母体高脂饮食和正常饮食的子代小鼠粪便样本，探究母体高脂饮食对子代小鼠的影响。
材料与方法
研究对象
8周龄C57BL/6雌性小鼠与C57BL/6雄性小鼠交配后，在妊娠期和哺乳期进行高脂（MHFD组）/正常（MCD组）饲料喂养。收集3周龄和8周龄子代小鼠的粪便进行16SrDNA测序分析，并测定相应的指标。
测序区域及平台
16SrDNAV3-V4区；IlluminaHiseqPE
技术路线图
研究成果
1、母体高脂饮食对子代早期肠道发育具有抑制作用
与MCD组相比，MHFD组中子代小鼠的体重在第2-4周有显著性增加，第3-8周时无显著性变化（图1B）。MHFD组小鼠空肠、回肠绒毛长度和结肠隐窝深度与对照组相比明显缩短（图1C,D），而第8周未发现类似的情况。
图1母体高脂饮食影响3周龄子代小鼠的肠道发育
A.实验路线图；B.子代小鼠的每周体重；C.小肠和结肠组织的HE染色；D.小肠绒毛长度和结肠隐窝深度。
MHFD组中小肠增殖细胞和结肠杯状细胞和MUC2阳性细胞数量显著降低（图2A-C）；同时，MHFD组中的结肠MUC2基因表达量降低。因此，母体高脂饮食可以改变子代小鼠的早期肠道发育和细胞分化。
图2母体高脂饮食影响3周龄子代小鼠的肠道细胞的增殖与分化
A.免疫染色法检测小肠细胞的增殖；B.PAS染色法检测结肠的杯状细胞；C.免疫染色法检测结肠的MUC2。
2、母体高脂饮食影响3周龄子代小鼠的肠道微生物结构
由Venn图显示结果可知，MHFD组和MCD组中OTU数目分别为和，共有OTU数目为（图3A）；
由物种丰度表可知，MHFD组中厚壁菌门和疣微菌门的相对丰度增加，厚壁菌门/拟杆菌门比值增加，而拟杆菌门相对丰度降低（图3B,C）；
MHFD组中的α多样性（Shannon和Simpson指数）显著降低（图3D）；
图3母体高脂饮食改变3周龄子代小鼠的肠道微生物α多样性
A.Venn图B.门水平的物种相对丰度；C.每只鼠在门水平上的物种相对丰度；D.Shannon和Simpson指数。
基于weightedUnifrac聚类的beta多样性分析（PCoA、Anosim）可知，两组之间差异显著（R=0.,P=0.），表明高脂饮食可以影响微生物的组成（图4A,B）；
MHFD组中与炎症相关的微生物（Streptococcus和Peptostreptococcaceae）的相对丰度增加，而与丁酸盐产生相关的微生物（Lachnospiracea_incertae_sedis和Prevotellaceae）的相对丰度显著性降低。同时，MHFD组中的Akkermansia菌相对丰度增加，猜测可能与3周龄子代粘膜屏障功能的破坏有关。
图4母体高脂饮食改变3周龄子代小鼠的肠道微生物β多样性
A.PCoA；B.Anosim；C.进化分支图。
3、母体髙脂饮食能够破坏3周龄子代小鼠的肠道屏障功能和诱导肠道低度炎症的发生
MHFD组血清中FITC-D的水平显著增加（图5A），表明肠道通透性增加，紧密连接完整性遭到破坏；
MHFD组中的紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3和ZO-1的mRNA相对表达量显著降低。除此之外，Occludin的mRNA相对表达量也降低（图5B），但不具有显著性差异（P=0.14）；
利用Westernblot方法检测ZO-1和CLDN3的蛋白表达水平，结果显示MHFD组中的ZO-1和CLDN3蛋白表达量均显著降低（图5C）；
ZO-1免疫染色结果表明母体高脂饮食改变了子代小鼠ZO-1在结肠上的膜定位（图5D）。图5母体高脂饮食破坏3周龄子代小鼠的肠道屏障功能
A.血清中异硫氰酸荧光素葡聚糖水平；B.结肠组织中CLDN1、CLDN3和ZO-1的mRNA相对表达量；C.WesternBlot检测结肠组织中ZO-1和CLDN3的蛋白表达量；D.免疫染色和荧光显微镜观察ZO-1的膜定位。
IgA免疫染色结果表明母体高脂饮食显著降低小肠中分泌IgA的阳性细胞数（图6A），且通过ELISA方法发现MHFD组中的粪便sIgA水平显著降低（图6B）。同时，MHFD组中的IL-1β,IL-6,IFN-γ和TNF-α的mRNA相对表达量显著增加（图6C，6D），然而，TGF-β的mRNA相对表达量没有显著变化（P=0.29）。
图6母体高脂饮食降低小肠中slgA水平并诱导结肠低度炎症发生
A.IgA阳性细胞数；B.ELISA方法测定粪便中slgA水平；C.IFN-γ的mRNA相对表达量；D.IL-1β,IL-6,TNF-α和TGF-β的mRNA相对表达量。
4、母体髙脂饮食诱导的子代小鼠菌群失衡在8周龄时未得到恢复
由Venn图显示结果可知，MHFD组和MCD组中OTU数目分别为和，共有OTU数目为（图7A）；
由物种丰度表可知，两组中的厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门的相对丰度没有显著性差异（图7B）；
MHFD组中的α多样性（Shannon和Simpson指数）有所增加，但不具有显著性差异（图7C）。
图7母体高脂饮食改变8周龄子代小鼠的肠道微生物α多样性
A.Venn图；B.门水平的物种相对丰度；C.Shannon和Simpson指数；D.PCoA。
基于weightedUnifrac聚类的beta多样性分析（PCoA、Anosim）可知，两组8周龄子代小鼠之间差异显著（R=0.,P=0.）（图8A）；
与产短链脂肪酸相关的微生物（Anaeroplasma和Lachnospiracea_incertae_sedis）在MCD组中显著富集。与炎症相关的微生物（Escherichia/Shigella,Helicobacter和Oscillibacter）在MHFD组中显著富集。除此之外，MHFD组中可能对粘膜具有有益作用的微生物（Mucispirillum和Barnesiella）的相对丰度降低（图8B）；
由PCoA图可知，尽管8周时小鼠的肠道微生物得到改善，但两组之间仍存在显著性差异（图8C）。
图8母体髙脂饮食诱导的子代小鼠菌群失衡在8周龄时未得到恢复
A.Anosim；B.物种丰度热图；C.PCoA。
5、母体高脂饮食增加8周龄子代小鼠对DSS诱导结肠炎的易感性
8周龄子代小鼠经过DSS处理5天后，MHFD组中第3、4和5天的DAI评分显著升高（图9A）；与MCD组相比，MHFD组中子代小鼠的结肠长度明显减少（图9B）；MHFD组中结肠HE染色发现中性粒细胞和淋巴细胞浸润增加，且隐窝结构破坏更加明显（图9C）。除此之外，与MCD组相比，MHFD组中的炎症/损伤分值显著升高（图9D）。MHFD组中的IL-6,KC和TNF-α的mRNA表达量显著增加（图9E）。
图9母体髙脂饮食增加8周龄子代小鼠对DSS诱导结肠炎的易感性
A.疾病活性指数；B.结肠长度；C.结肠HE染色观察；D.炎症/损伤分值；E.IL-6,KC和TNF-α的mRNA表达量。
研究结论
母体高脂饮食可能是子代IBD发生的潜在诱因。母体高脂饮食可以抑制子代小鼠的肠道发育、细胞增殖，改变微生物组成和多样性，诱导低度炎症并损伤粘膜屏障功能，增加子代对结肠炎的易感性。
亮点
本文首次对母体高脂饮食与子代IBD发生的关系进行研究，探究母体高脂饮食对子代肠道菌群及IBD表征指标的影响，阐述了IBD的可能发生机制，为预防IBD的发生提供了一个新的思路。
锐翌基因服务
锐翌基因采用IlluminaMiSeqPE测序策略对16SrDNA的V3+V4或多种单可变区进行测序，数据质量更高（Q30≥90%），测序通量显著提高；升级版后的分析内容，更加全面，并在原有的分析基础上提供自己的特色分析，给各位新老客户完美的测序体验。
供稿：党芳芳
编辑：王丽燕
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